琼脂糖凝胶电泳实验失败原因?
来源:学生作业帮 编辑:搜狗做题网作业帮 分类:综合作业 时间:2024/08/14 12:37:53
琼脂糖凝胶电泳实验失败原因?
实验首先是用PCR扩增DNA片段,然后用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量,结果失败了,EB染色后凝胶上没有出现亮带.请教各位牛人这些步骤里面可能出现问题的在哪里?
实验首先是用PCR扩增DNA片段,然后用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量,结果失败了,EB染色后凝胶上没有出现亮带.请教各位牛人这些步骤里面可能出现问题的在哪里?
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可能性太多了.
1.你跑胶一般都要放MARKER或者叫DNA LADDER吧,这个MARKER除外对DNA标记大小以外,还可以用来监控ELECTROPHORESIS的质量,如果MARKER显示而DNA没显示,说明ELECTROPHORESIS正常而DNA有问题,如果MARKER和DNA都没有显示,说明是你的电永出现了问题.
ELECTROPHORESIS的可能问题有,1.ELECTROPHORESIS BUFFER浓度问题,2.BUFFER太陈旧了从而失效 3.跑过了(根据SIZE来看)
2.如果证明是DNA复制也就是PCR的问题,可能性就太多了.
具体包括你所使用的PCR
BUFFER:浓度问题(需要1X),盐析问题(有时候放置太久其中的SALT会析出,溶解不透彻就会失效),氯化镁浓度问题.
DDNTP:浓度问题(可能配得浓度不够),陈旧性问题.
TAQ:你的酶有可能失效.
PRIMER问题:你的PRIMER可能NOT WORK.也可能你的ANNEALING TEM有问题,初次使用PRIMER的时候建议作温度的GRADIANT TEST,测试最佳ANNEALING TEM.PRIMER也可能太陈旧了,浓度或高或低.PRIMER容易行程DIMER.
PCR PROGRAMME的设置问题:这个最简单,建议仔细过一遍.
总之,如果是PCR的问题,建议每次保持其他不变,只改变其中的一项来把问题找出来,另外提醒你最好要作POSITIVE 和NEGATIVE CONTROL.
1.你跑胶一般都要放MARKER或者叫DNA LADDER吧,这个MARKER除外对DNA标记大小以外,还可以用来监控ELECTROPHORESIS的质量,如果MARKER显示而DNA没显示,说明ELECTROPHORESIS正常而DNA有问题,如果MARKER和DNA都没有显示,说明是你的电永出现了问题.
ELECTROPHORESIS的可能问题有,1.ELECTROPHORESIS BUFFER浓度问题,2.BUFFER太陈旧了从而失效 3.跑过了(根据SIZE来看)
2.如果证明是DNA复制也就是PCR的问题,可能性就太多了.
具体包括你所使用的PCR
BUFFER:浓度问题(需要1X),盐析问题(有时候放置太久其中的SALT会析出,溶解不透彻就会失效),氯化镁浓度问题.
DDNTP:浓度问题(可能配得浓度不够),陈旧性问题.
TAQ:你的酶有可能失效.
PRIMER问题:你的PRIMER可能NOT WORK.也可能你的ANNEALING TEM有问题,初次使用PRIMER的时候建议作温度的GRADIANT TEST,测试最佳ANNEALING TEM.PRIMER也可能太陈旧了,浓度或高或低.PRIMER容易行程DIMER.
PCR PROGRAMME的设置问题:这个最简单,建议仔细过一遍.
总之,如果是PCR的问题,建议每次保持其他不变,只改变其中的一项来把问题找出来,另外提醒你最好要作POSITIVE 和NEGATIVE CONTROL.